第二章 分离、纯化技术和显微技术
微生物的基本特点
- 在绝大多数情况下都是利用微生物的群体来研究起属性
- 微生物的物种（菌株）一般也是以群体的形式进行繁衍、保持
微生物培养类群
- 培养物：微生物学中，在人为规定的条件下培养繁殖得到的微生物群体称为培养物
- 混合培养物：含有多种微生物的培养物
- 纯培养物：只有一种微生物的培养物
微生物的分离和纯培养
无菌技术
- 用于分离、培养微生物的器具事先不含任何微生物
- 在转接、培养微生物时防止其他微生物的污染
**常见的器具：**试管、瓶子、培养皿等
常见的灭菌方法：
- 高压蒸气灭菌：高压蒸气灭菌锅，121度，20min
- 高温干热灭菌：电热恒温鼓风高温干燥箱，160度，2h
接种操作
无菌操作：火焰附近
分离纯培养
培养基
满足微生物的生长和繁殖
- 液体培养基
- 固体培养基
用固体培养基分离纯培养
菌落：单个微生物在适宜的培养基表面或内部生长、繁殖
菌苔：当固体培养基表面众多菌落连成一片时便形成菌苔
方法
- 涂布平板法
- 平板划线法
- 稀释倒平板法
- 厌氧微生物分离——稀释摇管法
选择培养分离
- 抑制大多数其他微生物生长
- 使待分离的微生物生长更快，使待分离的微生物在群落中的数量上升，方便用稀释法纯化
- 使得分离的微生物生长突出
- 直接挑取待分离的微生物的菌落得到纯化，微生物群落中数量占少数的微生物的分离纯化
选择培养基
- 利用选择培养基：待分离的微生物生长，其他微生物的生长被抑制
- 富集培养：利用不同微生物间生命活动特点的不同，制定的环境条件，使仅适应该微生物的生长
- 单细胞（孢子）分离：一般采用显微操作仪，在显微镜下进行；可以采取显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养
二元培养物
培养物中只含有两种微生物，而且是有意识的，保持两者之间的特定关系的培养物称为二元培养物
- 病毒和宿主细胞
- 纤毛虫、变形虫和粘细菌
微生物的菌种保藏技术
性状稳定的菌种是微生物学工作最重要的基本条件，否则生产或科研都无法正常进行
影响微生物菌种稳定性的因素：变异、污染、死亡
菌种保藏的基本要求：在一定时间内使菌种不死、不变、不乱
菌种的衰退和复壮
菌种衰退的原因：大量群体中的自发突变
菌种的复壮：
- 从衰退的菌种群体中把少数个体再找出来，重新获得具有原有典型性质的菌种
- 纯种分离；
- 通过寄主体进行复壮
- 有意识地利用微生物会发生自发突变的特性，在日常的菌种维护工作中不断地筛选“正变”个体
防止衰退的措施：
- 减少传代次数；
- 创造良好的培养条件；
- 经常进行纯种分离，并对相应的性状指标进行检查；
- 采用有效的菌种保藏方法；
显微镜与显微技术
光学显微镜：
- 普通光学显微镜
- 暗视野显微镜
- 相差显微镜
- 荧光显微镜
- 复式纤维性
电子显微镜：
- 电子束显微镜
- 高分辨率显微镜
染色
- 简单染色法
- 鉴别染色法
- 革兰氏染色法
- 抗酸性染色法（分歧杆菌）
- 特殊结构染色法
- 负染色——荚膜染色法
- 芽孢染色法
- 鞭毛染色法
革兰氏染色法
- 初染
- 媒染
- 脱色
- 复染
- 检测阳性/隐性
题目
在微生物学研究中，为什么要进行纯培养？
纯培养是微生物学研究的基础。由于微生物个体微小，研究其属性通常需要利用其群体。获得只含一种微生物的纯培养物，是准确研究特定微生物形态结构、生理生化特性和遗传特征的前提。
什么是无菌技术？其实施的目的是什么？
无菌技术是指在微生物实验操作过程中，防止被其它微生物污染和保持无菌物品及无菌区域不被污染的操作技术。由于微生物分布广泛，实施无菌技术的目的是确保用于分离培养的器具和培养基不含任何杂菌，并在操作过程中防止外界微生物的污染，从而获得准确的实验结果。
简述平板划线法（Streak-Plate Technique）的基本操作原理
平板划线法是利用接种环挑取少量菌样，在固体培养基平板表面进行分区划线。通过连续划线，使接种环上的菌量逐步稀释，最终在划线的末端区域分散成单个细胞，经培养后每个单细胞将生长繁殖形成独立的菌落。
涂布平板法（Spread-Plate Technique）与稀释倒平板法（Pour Plate）在操作和结果上有何主要区别？
主要区别在于接种方式和菌落生长位置。涂布平板法是将菌液滴加在已凝固的琼脂平板表面，然后用涂布棒涂匀，菌落仅在培养基表面生长。而稀释倒平板法是将菌液与尚未凝固的温热琼脂培养基混匀后，再倒入培养皿中凝固，因此菌落会在培养基的表面和内部生长。
解释富集培养（Enrichment Culture）的原理及其在微生物分离中的作用
富集培养是根据不同微生物的生命活动特点，设定特定的环境和培养条件（如特定营养源、温度等），使仅适应此条件的微生物旺盛生长。其作用是从复杂的微生物群落中筛选并提高目标微生物的数量比例，使其成为优势种群，从而更容易地将其分离纯化。
影响微生物菌种稳定性的主要因素有哪些？
影响微生物菌种稳定性的三个主要因素是：变异（微生物发生自发突变）、污染（被其他杂菌混入）和死亡（菌种丧失活性）。
菌种保藏的基本要求是什么？请列举两种使菌种处于休眠态的保藏方法。
菌种保藏的基本要求是在一定时间内使菌种“不死、不变、不乱”，即保持其存活性、遗传性状的稳定性和纯净度。使菌种处于休眠态的保藏方法包括干燥法（如沙土管保藏法、冷冻真空干燥法）和冷冻法（如液氮超低温保藏、低温冰箱保藏）。
在光学显微镜观察前，对样品进行固定（Fixation）和染色（Staining）的主要目的是什么？
对样品进行固定和染色的主要目的有三个：一是杀死微生物并将其牢固地附着在载玻片上；二是保存细胞的内外结构，防止其变形；三是通过染料增加细胞与背景的对比度，提高可见度，并突出特定的形态特征以便观察。
革兰氏染色法（Gram stain）包含哪四个关键步骤？
革兰氏染色法包含四个关键步骤：
1. 初染：使用结晶紫对所有细菌进行染色。
2. 媒染：加入革兰氏碘液，以增强染料与细胞的结合。
3. 脱色：用95%乙醇或丙酮进行处理，这是鉴别的关键步骤。
4. 复染：使用沙弗宁（番红）进行染色，使脱色的细菌呈现红色。