酶与酶动力学

酶通论

酶的概念

生物机体的一切生理活动，都是由无数复杂的化学变化（反应）来实现的

生物体内进行的所有这些化学变化都在酶的催化下进行

酶是生物催化剂

• 生物催化剂：活细胞产生的一类具有催化功能的生物分子
• 酶促反应：酶催化的生物化学反应
• 底物：在酶催化下发生化学变化的物质

酶与一般催化剂的共同点

• 改变化学反应速度，但不改变化学反应平衡
• 能稳定底物形成的过渡状态，降低反应的活化能，从而加速反应的进行
• 一般的化学催化理论和规律同样适用于生物催化体系
• 催化过程与非催化过程，催化剂通过降低反应的活化能，增加了活化分子的数量，从而增加了反应速率

酶作为生物催化剂的特点

• 更高的反应速率（高效）
• 更温和的条件
• 更高的反应专一性（专一）
• 可调节能力（可调）

酶易失活

• 酶对化学反应温度、压强、酸碱度有比较苛刻的要求
• 酶催化的反应普遍是在常温、常压和接近中性酸碱条件下进行

酶的化学本质及组成

酶的化学本质

• 除掉少数核酶外，绝大多数酶都是蛋白质
• 具有催化作用的蛋白质就是蛋白质酶
• 蛋白质酶具有蛋白质的所有性质
• 空间结构对其催化活性是必需的
• 空间结构比普通蛋白质更为复杂、易变性

酶的化学组成

• 单纯蛋白酶：除了蛋白质外，不含其他物质的酶
• 结合蛋白酶：由蛋白质和非蛋白部分共同组成的酶
  • 蛋白质部分：酶蛋白
  • 非蛋白部分：辅因子
• 全酶：酶蛋白+辅因子
  • 辅因子：分为两种
    • 辅酶：与酶蛋白非共价结合，结合松弛，可用透析法除去
    • 辅基：与酶蛋白共价结合，结合紧密，不能用透析法除去

酶的活性中心

定义：酶分子上与底物结合并与催化作用直接相关的区域

• 结合基团：负责与底物结合，决定酶的专一性
• 催化基团：参与催化，决定酶的催化能力

单体酶：由一条肽链组成的酶；有的单体酶由多条肽链组成，肽链间通过二硫键相连

寡聚酶：由两个或两个以上亚基组成的酶亚基之间靠次级键结合，容易分开

多酶复合体：由几种酶靠非共价键彼此嵌合而成

酶的分类与命名

习惯命名法

• 根据其催化底物来命名：如淀粉酶
• 根据所催化反应的性质来命名：如水解酶
• 结合上述两个原则来命名：如乙醇脱氢酶
• 有时在这些命名基础上加上酶的来源或其他特点：如胃蛋白酶

国际系统命名法

• 氧化还原酶类
• 转换酶类
• 水解酶类
• 裂合酶类
• 异构酶类
• 合成酶类

酶的底物专一性

酶对参与反应的底物有严格的选择性，即一种酶仅能作用于特定的底物分子，使其发生某种特定类型的化学反应，并产生特定的产物

类型

关于酶作用专一性的假说

• 锁钥学说：认为整个酶分子的天然构象是具有刚性结构的，酶表面具有特定的形状，酶与底物的结合如同一把钥匙对一把锁一样
• 诱导契合学说：该学说认为酶表面并没有一种与底物互补的固定形状，而只是由于底物的诱导才形成了互补形状

酶活力的测定

酶活力

• 指酶催化某一化学反应的能力
• 反应速率愈大，活力愈高；反应速率愈小，活力愈低
• 酶活力的测定就是测定酶促反应的速率，即单位时间内底物减少量或产物的增加量

反应速率的测定

• 反应速率=曲线的斜率
• 测定酶活力，应测定反应的初速率 $v_0$
• $v_0$：底物浓度的变化在起始浓度5%以内的速率

酶的活力单位

表示酶活力大小的量度

在一定条件下，一定时间内将一定量的底物转化为产物所需的酶量为一个活力单位

一个酶活力国际单位（IU）：在最适反应条件（指最适pH、温度25度等）下，1分钟内就能催化1微摩尔底物转化为产物所需的酶量

酶的比活力：表示酶的纯度，即酶的含量，每毫克蛋白所含的酶活力单位数，对同一种酶来说，比活力越大，表示酶的纯度越高

比活力=活力U/mg蛋白=总活力U/总蛋白mg

酶的转换数（TN）：一定条件下（当酶被底物饱和时），没秒钟每个（或每 $\mu mol$）酶分子转换底物的分子数（或 $\mu mol$数）

酶促反应动力学

是研究酶促反应的速率以及影响此速率的各种因素的科学

反应级数

• 零级反应：反应速率愈反应物浓度无关而受它种因素影响而改变的反应，即反应速率为一常数
• 一级反应：反应速率只与反应物的浓度的一次方呈正比
• 二级反应：反应速率与反应物的浓度的二次方（或两种物质浓度的乘积）呈正比

底物浓度[S]对酶反应速率的影响

中间产物学说（米式学说）

• 低浓度——一级反应
• 中间范围浓度——混合级反应
• 高浓度——零级反应过渡

当酶催化某一化学反应时，酶首先和底物结合生成酶-底物中间复合物，然后生成产物，并释放出酶

$$S+E\rightleftharpoons ES\to P+E$$

米氏方程

米氏常数 $K_m$ 的定义：反应速率为最大值一半时的底物浓度

当 $v_0=1/2V_{max}$ 时， $K_m=[S]$

• 当 $[S]<<K_m$ 反应速度与底物浓度成正比，反应相对底物S是一级反应，酶没有被底物饱和

• 当 $[S]>>K_m$ 反应速度接近于一个恒定值，酶几乎被底物饱和，这个反应相对于底物S是个零级反应

• 当 $[S]=K_m$ 反应速度为最大速率的一半

  $$v=\frac{v_{max}[S]}{[S]+[S]}=\frac{v_{max}}{2}$$

米氏常数的意义

1. $K_m$ 是酶一个重要的特征物理常数， $K_m$ 的大小只与酶的性质有关，与酶的浓度无关
   • 不同的酶具有不同的 $K_m$ 值
   • 同种酶，不同的底物具有不同的 $K_m$
   • 同种酶，固定底物，不同条件下具有不同的 $K_m$ 值
2. $K_m$ 可以判断酶的专一性和天然底物
3. 在一定条件下， $K_m$ 表示酶与底物间的轻和程度（负相关）
4. 通过已知的 $K_m$ 值，可以计算出在某一底物浓度时反应速率相当于 $v_{max}$ 的百分率
5. $K_m$ 值可以帮助推断某一代谢反应的方向和途径
6. 当达到 $v_{max}$ 的时候，此时所有的酶都在干活，因此 $[E]=[ES]$，由中间产物学说的第二步可得， $ES{\to }^{k_2}E+P$，因此 $v_{max}=k_2[E]$，其中 $k_2$ 越大，转换效率越高
7. 生理条件下， $[S]<<K_m$ 时， $k_{cat}/K_m$ 的值可以作为酶促反应速率大小的衡量

$K_m$ 和 $V_{max}$ 的求法

双倒数作图法：

$$\frac{1}{V_0}=\frac{K_m}{V_{max}[S]}+\frac{1}{V_{max}}$$

多底物的酶促反应

• 按动力学机制分为：
  1. 序列反应
     1. 有序反应
     2. 随机反应
  2. 乒乓反应

酶浓度对酶反应速率的影响

pH对酶反应速度的影响

• 在一定的pH下，酶具有最大的催化活性，通常称此pH为最适pH
• 最适pH是酶的特性之一，但不是酶的特征物理常数

pH影响酶活力的可能原因

• 影响活性中心的解离状态
• 影响酶的空间构象
• 影响底物的解离状态

温度对酶反应速度的影响

• 一方面温度升高，酶促反应的速度加快
• 另一方面温度升高，酶的高级结构将发生变化甚至变形金刚，导致酶活性降低甚至丧失
• 在最适温度条件下，反应速率最大

抑制剂对酶促反应速度的影响

• 酶的抑制作用：使酶的活性降低或丧失的现象
• 抑制作用与失活作用的异同：是否变性，是否有选择性
• 抑制剂：能够引起酶的抑制作用的化合物

抑制作用的类型

可逆抑制作用和不可逆抑制作用的区别

• 不可逆抑制剂的 $V_{max}$ 不变，随着酶的投入量的增加逐渐恢复

不可逆抑制作用

• 抑制剂与酶活性中心基团共价结合，引起酶活性永久性丧失
• 酶的修饰抑制
• 不能用透析等物理方法除去抑制剂

可逆的抑制作用

• 抑制剂与酶蛋白非共价结合，引起酶活性暂时性丧失，除去抑制剂后，能部分或全部恢复酶的活性
• 能通过透析等物理方法除去抑制剂

根据抑制剂与底物的关系，可逆的抑制作用又可分为：

• 竞争性抑制
• 非竞争抑制
• 反竞争抑制

竞争性抑制（有它没我，有我没它）

• 抑制剂化学结构与底物相似，二者与酶活性中心的结合存在竞争关系
• 抑制剂与酶活性位点结合后，底物被排斥在反应中心外，结果酶促反应被抑制
• 竞争性抑制通常可以通过增大底物浓度，即提高底物的竞争能力来消除

$$v_0=\frac{V_{max}[S]}{K_m^{{}^{\prime }}+[S]}=\frac{V_{max}[S]}{\alpha K_m+[S]}$$

• $V_{max}$ 不变
• $K_m$ 变大

非竞争性抑制（有它没它，我都行）

• 酶可同时与底物及抑制剂结合，引起酶分子构象改变，导致酶活性下降
• 抑制剂、底物与酶活性中心的结合无竞争关系
• 又称混合型抑制剂

$$v_0=\frac{V_{max}[S]}{\alpha K_m+{\alpha }^{{}^{\prime }}[S]}$$

• $V_{max}$ 变小
• $K_m$ 可变（ $K_i\ne K_i^{{}^{\prime }}$）；不变（ $K_i=K_i^{{}^{\prime }}$）
  • 不变（ $K_i=K_i^{{}^{\prime }}$）：抑制剂结合游离酶（E）的能力，和结合复合物（ES）的能力完全一样，抑制剂虽然能结合酶，但它结合的位置完全不影响底物的进入（结合互不干扰），它只是通过改变酶的构象，让酶“中毒”无法催化，此时表现为， $V_{max}$ 减小，但是 $K_m$ 不变（非竞争抑制）
  • 变大（ $K_i\ne K_i^{{}^{\prime }}$）：抑制剂更喜欢游离酶（E），而不是复合酶（ES），虽然抑制剂两边都能结合，但它更倾向于去抢占游离的酶，它消耗了大量的游离酶（E），这与底物形成了某种程度上的竞争（竞争抑制）
  • 变小（ $K_i<K_i^{{}^{\prime }}$）：抑制剂更喜欢与复合酶（ES）结合，从而稳定了ES复合物的构象，从而在表观上看，从E+S→ES的过程是在增加的，从而导致 $K_m$ 减小（反竞争抑制）

可逆抑制剂

• 可逆抑制剂中最重要和最常见的是竞争性抑制剂
• 磺胺类药物 - 竞争性抑制剂

题目

什么是酶的活性部位？它由哪两个功能部分组成，各自的作用是什么？

酶的活性部位是酶分子上能与底物特异性结合并催化其发生化学反应的空间区域。它由“结合部位”和“催化部位”组成。“结合部位”负责识别并结合底物，决定了酶的专一性；“催化部位”则直接参与化学键的断裂与形成，决定了酶的催化能力。

简述竞争性抑制作用的机制及其对酶动力学参数Vmax和Km的影响

竞争性抑制剂的化学结构与底物相似，因此能与底物竞争酶的活性部位。当抑制剂结合到活性部位后，底物便无法结合，从而抑制了酶促反应。这种抑制作用会导致酶的米氏常数（Km）增大，但最大反应速率（Vmax）保持不变，因为可以通过提高底物浓度来逆转抑制效应。

不可逆抑制作用与可逆抑制作用有何根本区别？请举一个不可逆抑制剂的例子

根本区别在于抑制剂与酶的结合方式和可逆性。不可逆抑制剂通常通过共价键与酶的活性中心基团结合，导致酶活性永久性丧失，且不能用透析等物理方法除去。可逆抑制剂则通过非共价键与酶结合，活性丧失是暂时的，除去抑制剂后酶活性可以恢复。例如，有机磷化合物二异丙基氟磷酸酯（DIFP）就是一种不可逆抑制剂。

解释非竞争性抑制（混合型抑制）的基本原理。在这种抑制作用下，Vmax和Km会发生怎样的变化？

在非竞争性抑制中，抑制剂与底物结合在酶分子的不同位点，二者之间没有直接的竞争关系，抑制剂可以与游离酶（E）结合，也可以与酶-底物复合物（ES）结合。这种抑制作用总是导致最大反应速率（Vmax）降低。米氏常数（Km）则可能变大、变小或不变，这取决于抑制剂对E和ES亲和力的相对大小。

什么是别构酶？与遵守米氏方程的酶相比，别构酶在动力学曲线上有何典型特征？

别构酶是除了活性中心外，还具有别构部位的酶，其活性可以被别构效应剂（激活剂或抑制剂）调节。与遵守米氏方程的酶所呈现的双曲线动力学曲线不同，别构酶通常表现出“S”型的动力学曲线，这反映了其亚基间的协同效应（正协同）。

简述酶原激活的定义和生理意义。这种激活过程是可逆的吗？

酶原激活是指某些酶首先以无活性的前体（酶原）形式合成，随后通过有限的蛋白水解切除部分肽段，引发构象变化，从而转变为有活性的酶。这一机制可以防止酶在不适当的时间和地点造成损害，如消化道中的蛋白酶。这个激活过程是不可逆的。

酶催化高效性的机制之一是“邻近与定向效应”，请解释这两个效应如何提高反应速率。

“邻近效应”指酶将反应底物（或底物与催化基团）结合在活性部位，极大地提高了它们的局部有效浓度。“定向效应”指酶不仅使底物靠近，还将其以最有利于反应发生的精确空间朝向进行排列。这两个效应协同作用，显著增加了反应发生的几率，从而大幅提高反应速率。

共价催化是如何加速化学反应的？请列举酶分子中能参与共价催化的常见氨基酸残基。

共价催化机制中，酶的活性部位上的亲核基团会攻击底物，与底物（或其一部分）形成一个短暂的、不稳定的共价中间体。这个新的反应路径相较于原来的路径具有更低的活化能，从而加速了整体反应。酶分子中常见的参与共价催化的基团包括丝氨酸（-OH）、半胱氨酸（-SH）、组氨酸（咪唑基）和天冬氨酸（-COOH）等。

在胰凝乳蛋白酶的催化三联体中，是哪三个氨基酸残基？它们如何协同作用以水解肽键？

胰凝乳蛋白酶的催化三联体由丝氨酸-195（Ser195）、组氨酸-57（His57）和天冬氨酸-102（Asp102）组成。在催化过程中，His57作为广义碱夺取Ser195的质子，使其成为强亲核试剂攻击底物肽键的羰基碳；Asp102则通过氢键稳定His57的质子化状态，增强其作为质子受体的能力。

酶活性的共价修饰调控是什么？请举出最常见的一种修饰类型及其相关的酶。

酶活性的共价修饰调控是指通过在酶蛋白的特定氨基酸残基上可逆地共价连接或移除一个化学基团，来改变酶的活性状态。最常见的修饰类型是磷酸化和去磷酸化。这一过程由蛋白激酶（催化磷酸化）和蛋白磷酸酶（催化去磷酸化）两类酶共同完成。